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快速檢測食品中黃曲-mei素

總黃曲霉--毒素(AFs)酶聯(lián)免疫測試方法介紹
  一、黃曲-mei素afs快速檢測的意義：黃曲霉-毒素是由曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。主要污染玉米、花生、堅果等。天然污染的黃曲霉-毒素以AFB1、AFB2、AFG1、AFG2為主，總黃曲霉-毒素一般指這四種毒素的總量。黃曲-霉毒素屬于zui強烈的天然致癌物質(zhì)，肝臟是其主要的靶器官，其中AFB1毒性zui強，具有*的急性毒性和致癌性。其檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)，本試劑盒可以準確快速檢測糧谷類和花生及飼料中的總黃曲-霉毒素。

二、黃曲-mei素測定原理：利用用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，利用間接競爭ELISA法進行測定。用抗原包被微孔板，加入黃曲-霉毒素B1標準品或樣品、總黃曲霉-毒素單克隆抗體進行免疫反應后，將未與包被抗原結合的抗體洗去;再加入酶標記的抗鼠IgG抗體孵育，加入底物顯色，終止液終止后，用酶標儀在450nm處測定OD值。

三、快速檢測實驗操作所需的試劑及材料：微孔板 包被有AFB1-BSA；5個濃度的AFB1標準溶液各(1mL)可直接使用；標準1：0ng/mL 可直接使用；標準2：1.0ng/mL可直接使用；標準3：2.0ng/mL 可直接使用；標準4：5.0ng/mL可直接使用；標準5：10.0ng/mL 可直接使用；AFS單克隆抗體溶液(6mL)可直接使用；酶標物(12mL)可直接使用；顯色液(12mL)；終止液(6mL)；濃縮洗液(30mL) ；空白對照(6ml)微孔板酶標儀(含450nm)：定量分析用；振蕩器，粉碎機，微量移液器，量筒，漏斗和容量瓶，快速定性濾紙；試劑：氯化鈉(分析純)、甲醇(分析純)、去離子水或蒸餾水

四、檢驗操作注意事項：標準溶液中含有黃曲-霉毒素，應特別小心。使用過的玻璃容器及黃曲-霉毒素溶液zui-好用pH7的次氯酸溶液(10%v/v)浸泡過夜。終止液為0.5N硫酸，避免接觸皮膚。不要交換使用不同批號盒中的試劑。

五、黃曲-mei素檢驗實驗樣品前處理：樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存，取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化鈉及25mL70% 甲醇-水，強力振蕩3分鐘；用快速定性濾紙過濾；取1mL濾液，用1%氯化鈉溶液稀釋10倍；取50μL稀釋液進行分析；據(jù)需要可以增加樣品量，但甲醇溶液的量也應相應增加。

六、檢驗實驗注意事項和測定程序：每次加樣后立即將所有試劑放回2-8 ℃，每步操作時間控制在5min內(nèi)， 孵育過程中應避光。測定程序1. 取所需數(shù)量的板條插入微孔架，記錄樣品及標準的位置。2. 加入50mL標準品或處理好的樣品到微孔，每個標準和樣品必須使用新的吸頭。3. 將50mL抗總黃曲-霉毒素單克隆抗體使用液加入到每個微孔(注意移液器管尖不要接觸到放進孔中的液體，避免交叉污染)，在適當位置孔加空白對照液100mL，37℃孵育90min。4. 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。5. 每孔加入酶標物100mL，37℃孵育60min。6. 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。7. 每孔加入顯色液100mL(2滴)，37℃孵育10 min -12min。8. 每孔加入終止液50mL(1滴)，立即用酶標儀在波長為450nm處測定吸光度值(OD值)。

黃曲-霉毒素B1(AFB1)酶聯(lián)免疫定量檢測方法
一、黃曲-mei素含義和檢測原理：黃曲-霉毒素是由曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，主要污染玉米、花生、堅果等。天然污染的黃曲-霉毒素以AFB1為主，AFB1屬于強烈致癌物質(zhì)，肝臟是其主要的靶器官，具有*的急性毒性和致癌性。AFB1檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和ELISA方法，本試劑盒是以應用單克隆抗體為基礎的ELISA檢測方法，可以準確快速檢測糧谷類和花生及飼料中的AFB1。測定原理才采用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，利用間接競爭ELISA法進行測定。用抗原包被微孔板，加入AFB1標準品或樣品、抗AFB1單克隆抗體進行孵育后，將未與包被抗原結合的抗體洗去;再加入酶標記的抗鼠IgG抗體孵育，加入顯色液，經(jīng)過終止液終止后，用酶標儀在450nm處測定OD值。

二、實驗所需提供的耗材物品：微孔板包被有AFB1-BSA5個濃度的AFB1標準溶液(各0.5mL)。標準1：0ng/mL可直接使用；標準2：0.1ng/m可直接使用；標準3：0.2ng/mL可直接使用；標準4：0.5ng/m可直接使用；標準5：1.0ng/m可直接使用；抗AF B1單克隆抗體溶液(6mL)可直接使用；酶標物(12mL)可直接使用；顯色液(12mL)可直接使用；終止液(6mL)可直接使用；濃縮洗液(30mL) 稀釋使用；微孔板酶標儀(可于450nm處測定)、振蕩器、粉碎機、微量移液器；量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙；氯化鈉(分析純)、甲醇(分析純)、去離子水或蒸餾水。

三操作者注意事項：1、標準溶液中含有黃曲-霉毒素，應特別小心。2、使用過的玻璃容器及黃曲-霉毒素溶液zui-好用pH7的次氯酸溶液(10%v/v)浸泡過夜。3、終止液含有硫酸，避免接觸皮膚。4、每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。5、每步加樣時間應控制在5min內(nèi)。6、孵育過程中應避光。不要交叉使用不同批號的試劑。實驗試劑儲存條件：保存試劑盒于2~8℃；不要冷凍.顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2~8℃保存。

四、實驗測試樣品的處理：樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存；取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化鈉及25mL70%甲醇-水溶液；強力振蕩3分鐘；用快速定性濾紙過濾；取1mL濾液，加水4mL進行稀釋；取50μL稀釋液進行分析；根據(jù)需要可以增減樣品量，但甲醇-水溶液的量也應相應增減。

五、檢測實驗中酶免疫分析程序：1、濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。2、取所需數(shù)量的板條插入微孔架，用洗液洗滌微孔板3min×2次。3、加入50mL標準品或處理好的樣品到微孔，記錄樣品及標準的位置，每個標準和樣品必須使用新的吸頭。4、加入50mL抗體溶液到每個微孔(注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染)中，37℃孵育90min。甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。每孔加入酶標物100mL，37℃孵育60min。用洗液洗滌微孔板3min×5次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。5、每孔加入顯色液100mL(2滴)，37℃孵育10~12min。6、每孔加入終止液50mL(1滴)，立即用酶標儀在波長450nm處測定吸光度值(OD值)。在定量分析中，顯色液和終止液需要用移液器準確量取。

六、黃曲-mei素檢驗實驗樣品濃度計算方法：以標準溶液OD值與標準1OD值的比值為縱坐標，所對應標準溶液濃度(ng/mL)的對數(shù)值為橫坐標，制作標準曲線。根據(jù)樣品OD值與標準1OD的比值，可從曲線上得到對應點的橫坐標，即為AFB1濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中AFB1濃度C(ng/mL)，按下列公式計算出樣品中AFB1含量：AFB1含量(mg/kg)= C×K式中：C：稀釋后樣品提取液中AFB1含量(ng/mL)K：樣品稀釋倍數(shù)(按照本說明書中樣品處理程序方法為25)

七、試劑主要技術指標及參數(shù)

測試盒zui低檢出濃度0.1ng/mL，回收率70%~120%，與AFB2的交叉反應系數(shù)小于1%，與AFG1的交叉反應系數(shù)為4.65%，與AFG2交叉反應系數(shù)小于1%。試劑盒校正曲線的線性范圍0.1~1.0ng/mL，試劑盒條內(nèi)變異<10%，條間變異<15%。